阿尔兹海默症(AD)是全球范围内导致死亡的主要疾病之一，随着全球预期寿命的延长，这种疾病的发病率也越来越高。目前阿尔兹海默症的定义是基于新皮质淀粉样β斑块和tau神经纤维缠结的沉积，但是疾病的其它生化和细胞变化仍不完全清楚。本期iProteome为大家带来是的去年四月份埃默里大学AllanI.Levey教授及其合作团队NatureMedicine上发表的有关阿尔兹海默症的相关工作。
撰文｜马发含
作者使用定量质谱和共表达网络分析对阿尔茨海默病进行了迄今为止最大的蛋白质组学研究。一个与糖代谢相关的蛋白质网络模块成为与阿尔茨海默病病理和认知障碍最显著相关的模块之一。该模块富含阿尔茨海默病遗传风险因素以及与抗炎状态相关的小胶质细胞和星形胶质细胞蛋白标记物，表明其所代表的生物功能在阿尔茨海默病中起保护作用。该模块的蛋白质在疾病早期的脑脊液中升高。在这项通过定量蛋白质组学对超过个大脑和近个脑脊液样本进行的研究中，确定了AD大脑中的蛋白质和生物过程，这些蛋白质和生物过程可能作为该疾病的治疗靶点和液体生物标志物。
蛋白质共表达分析是了解人类组织中生物网络、通路和细胞变化的有力工具。共表达蛋白质的模块可以与疾病过程相联系，其中模块中最强相关的蛋白质或“hub”富含疾病发病的关键驱动因素。因此针对与疾病生物学最相关的蛋白质是药物和生物标志物开发的一种有前景的方法。这篇文章中作者进行了一项多中心的研究，该研究基于定量质谱的蛋白质组学分析了多例人类脑组织。从多个机构获得的例大脑组织中生成了一个共识AD蛋白共表达网络。并且在一个独立队列中使用不同的蛋白质组定量技术来验证这个蛋白质网络，结果表示这个蛋白质网络保存在受AD影响的不同脑区域。通过分析一组单独的正常衰老大脑，能够估计衰老对观察到的AD大脑蛋白共表达网络的影响。作者还通过蛋白质网络在其它六种神经退行性疾病的变化来分析AD蛋白网络变化的疾病特异性，这些疾病包括不同的脑病理，并通过靶向蛋白测量来验证观察到的变化。其中变化最大的一个共表达模块，星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块，富含与小胶质细胞、星形胶质细胞和糖代谢相关的蛋白质，并富含与AD遗传风险因子相关的蛋白质产物。该模块中的小胶质细胞蛋白标记物偏向于抗炎疾病相关状态，表明其反映了对AD病理的保护或补偿功能。来自该模块的蛋白质在患有AD的个体的脑脊液中增加，包括在疾病的无症状阶段。这些结果强调了炎症、糖代谢、线粒体功能、突触功能、RNA相关蛋白和胶质细胞在AD发病机制中的重要性，并为未来AD脑和生物流体生物标志物的蛋白质组学和多学科研究提供了一个强大的框架。
Results
共识AD蛋白共表达模块的构建和验证
作者分析了44例来自BLSA、例来自Banner、例来自MSSB和65例来自ACT的背外侧前额叶皮质组织（DLPFC），总共例包含对照、AsmyAD和AD。组织通过LFQ（无标定量）的方法进行蛋白质组的测定，总共鉴定到个蛋白质。在随后的分析中作者选择缺失值少于50%的蛋白。通过回归消除了年龄、性别和死亡时间间隔对蛋白质定量数据的影响，最终选择个蛋白进行WGCNA生成蛋白质共表达网络，包含13个模块。模块大小从个蛋白质(M1)到20个蛋白质(M13)。这些模块也可以使用t-SNE独立于WGCNA算法进行识别，证明由WGCNA算法识别的蛋白质模块是鲁棒的。对蛋白质模块GO分析揭示了13个模块中的11个模块的明确本体，包括生物功能、过程和组件的不同组合（图1b）。为了评估给定的共表达模块是否与AD相关，作者将模块特征蛋白与AD的神经病理学标记、淀粉样β斑块和神经纤维缠结进行关联。作者还将特征蛋白与MMSE评估的认知功能和由CDR评估的痴呆进行相互关联，以捕获可能独立于淀粉样β斑块或tau缠结病理的模块-疾病关系（图1b）。
图1有症状和无症状AD脑组织蛋白共表达网络分析
其中有6个模块，它们与所有病理、认知和功能测量显著相关，并且它们的本体可以用结构成分或生物过程来最好地表征:模块M1突触、M3线粒体、M4葡萄糖和碳水化合物代谢(随后称为糖代谢)、M5细胞外基质、M6细胞骨架和M10RNA结合/剪接。M4糖代谢模型显示最强的阿尔茨海默病性状相关。因为即使是在同一脑区，AD的神经病理学也是异质性的，并且这些神经病理学测量是半定量的，评估时受到一定程度的个体差异影响。作者还将模块特征蛋白与用于蛋白质组分析的DLPFC组织中淀粉样β和tau微管结合区的质谱测量相关联。观察到AD病理的神经病理学和分子测量之间有很强的一致性。
因为大脑中许多蛋白质共表达的变化可以由细胞类型的变化驱动，通过分析模块是否富含特定的细胞类型标记蛋白来评估每个共表达模块的细胞类型性质(图1b)。观察到M1突触模块中神经元蛋白的显著富集和M2髓鞘模块少突胶质细胞标记物的显著富集。另外还观察到星形胶质细胞和小胶质细胞蛋白在M4糖代谢模块中富集，小胶质细胞和内皮细胞蛋白在M5细胞外基质模块中富集，内皮细胞标记物在M7翻译/核糖体模块中富集。这些发现表明，每个模块的基因分析所反映的生物过程可能在特定的细胞类型中发生改变。为了将每个模块的细胞类型特性纳入其描述中，随后将那些细胞类型富集的模块称为“M1突触/神经元”模块、“M2髓鞘/少突胶质细胞”模块、“M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢”模块和“M5内/微细胞外基质”模块。
为了评估网络模块与诊断分类的关系，通过病例状态比较了模块特征蛋白值水平(图1c)。一般来说，与对照组相比，AD中增加或减少的大多数模块在AsymAD组中也显示出相同方向的趋势或显著变化，这表明这些模块反映了在AD临床前阶段早期开始的病理生理学过程。M1突触/神经元、M3线粒体和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块因病例状态不同而差异最大。作者还评估了APOE基因型对模块特征蛋白的影响，但除了M2髓磷脂/少突胶质细胞模块上的APOEε2等位基因之外，没有发现强影响，该等位基因似乎减弱了AD中观察到的变化(补充图1)。
为了验证AD网络，作者还分析了个来自ROS/MAP的DLPFC脑组织，使用TMT的方法进行蛋白质组测定。使用网络模块保守统计以及合成模块特征蛋白来评估AD网络保守性（图5b和5c）。发现所有共识LFQ模块都保存在基于TMT的ROS/MAP网络中。此外，通过另一种质谱蛋白质定量方法——选择性反应监测(SRM)——在个活ROS/MAP对照、AsymAD和AD中进行的靶向蛋白质测量表明，单个模块蛋白质与它们所属的基于LFQ的AD网络共表达模块具有相同的变化方向。总之，作者通过对来自多个中心的多个人类DLPFC脑组织进行基于质谱的蛋白质组分析，构建一个强大的AD蛋白共表达网络。许多这些模块与阿尔茨海默病的神经病理学和认知功能相关，反映了许多不同的生物过程和细胞类型，并在阿尔茨海默病的临床前阶段发生了改变。
AD网络存在其它脑区
从DLPFC组织分析产生的共识AD网络。为了评估该网络在通常受AD影响的其他大脑区域中是否相似，作者使用LFQ-质谱分析了来自MayoClinc的个自颞皮层的对照和AD脑组织，以及来自BLSA的同一组大脑中的楔前叶的对照、AD脑组织(图2a)。为每个脑区域构建了共表达网络，并且使用网络保存统计来评估来自颞皮层中的DLPFC的模块保存(图2b)和楔前叶的模块保存(图2c)。作者发现所有来自DLPFC的共识AD网络模块都保存在颞叶皮层，13个模块中有12个保存在楔前叶。通过病例状态对合成模块特征蛋白值的分析显示，在颞叶皮层(图2d)和楔前叶(图2e)大脑区域的病例组之间存在相似的差异，楔前叶中的AsymAD变化比DLPFC中的更明显。这些发现表明，共识性阿尔茨海默病网络在通常受阿尔茨海默病影响的大脑区域中是普遍的。
图2AD模块存在大脑的不同区域
衰老对AD模块的影响
为了更好地理解衰老(AD的最大风险因素)对共识AD网络的影响，作者通过LFQ-质谱分析了84名年龄在30至69岁之间的个体的DLPFC组织(图3a)。所有个体都有对照神经病理学诊断。从共有的AD网络模块中创建了老化队列中的合成特征蛋白，并分析合成模块特征蛋白是否随着年龄而变化(图3b)。作者发现M1突触/神经元和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块分别随着年龄的增长而减少和增加，而M3线粒体和M10RNA结合/剪接模块不受年龄的影响。其他似乎受衰老影响的模块包括M6细胞骨架、M7翻译/核糖体和M9翻译/核糖体模块。补充表3提供了关于单个蛋白质与年龄的相关性以及与细胞衰老标记重叠的额外信息。这些发现表明，衰老和阿尔茨海默病在蛋白质组水平上的关系是复杂的，并且一些但不是所有的阿尔茨海默病性状相关模块都受到衰老过程的影响。
图3衰老对AD网络模块的影响
AD蛋白网络模块在其它神经推行性疾病中的变化
为了探索这些网络变化对AD的特异性，作者通过LFQ-质谱分析了来自对照个体和患有AD、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶变性(TDP-43病理学)(FTLD-TDP)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底变性(CBD)、帕金森病和帕金森病痴呆(PD/PDD)和多系统萎缩(MSA)的患者的个DLPFC组织(图4a)。为共有的阿尔茨海默病网络模块创建了合成特征蛋白，并评估了与阿尔茨海默病相比，它们在不同的神经退行性疾病中是否发生了变化（图4b）。作者发现，M1突触/神经元和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块在FTLD-TDP和CBD病例中显示出显著变化，类似于AD，而M3线粒体和M10RNA结合/剪接模块在其他疾病中显示出更多混合变化。为了进一步验证这些发现，作者使用了一种称为平行反应监测(PRM)的靶向质谱方法来测量来自非靶向实验中分析的大约三分之一个体的个体的蛋白质。其中所有病例的蛋白质水平在LFQ和PRM测量值之间高度相关。通过阿尔茨海默病共识模块进行目标PRM蛋白测量生成合成特征蛋白，并按疾病类别评估特征蛋白变化。与非靶向相比，作者观察到跨疾病的非常相似的AD网络模块变化，验证了非靶向LFQ测量的发现。这些结果表明，与其他神经退行性疾病相比，某些AD网络模块在AD中受到更大程度的影响，并且FTLD和CBD显示出与AD相似的许多变化，但是并非所有神经退行性疾病在疾病的晚期都会同等地影响DLPFC区域。
图4AD蛋白网络模块在其它神经推行性疾病中的变化
M4模块富集AD遗传风险因子和抗炎性疾病相关的小胶质细胞标记物
作者应用了一种算法，根据蛋白质与通过AD全基因组关联研究(GWASs)发现的与AD相关单核苷酸多态性的连锁不平衡，计算蛋白质的加权疾病风险评分。然后计算给定的AD网络模块是否富含这些风险因子蛋白。作者发现，M2髓磷脂/少突胶质细胞和M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块在阿尔茨海默病危险因子基因座中的基因产物中显著富集(图5a)，表明这些蛋白共表达模块反映的生物学功能或过程可能在阿尔茨海默病中起致病作用。
鉴于M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块与阿尔茨海默病的遗传危险因素之间的强相关性，作者对这种共表达模块的细胞类型性质进行了更深入的研究。虽然M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块的表达随着从正常状态向阿尔茨海默病状态的进展而增加，并且阿尔茨海默病中大多数显著增加的蛋白质是该模块的成员，但尚不清楚这些胶质细胞反应是有害的还是保护性的。为了更好地理解胶质细胞类型反应在阿尔茨海默病中的作用，作者首先通过在阿尔茨海默病动物模型中与星形胶质细胞和小胶质细胞蛋白标记物相关的细胞表型类型来检测它们在阿尔茨海默病脑中的差异表达。发现，对于星形胶质细胞标记物和小胶质细胞标记物，似乎有一种倾向于表达通常被认为是保护性的标记物。用AD网络中的标记过表达分析测试了这一观察结果(图5b)。小胶质细胞蛋白标记物，对淀粉样β蛋白斑块响应表达增加，但LPS响应表达减少（或者是抗炎性疾病相关的小胶质细胞标记物），它们在M4模块中显著富集。星形胶质细胞标记物在M4模块中更混合，大多数标记物在有害A1和保护A2表型都有。图5c显示了星形胶质细胞和小胶质细胞表型标记，其通过M4模块中的模块特征蛋白相关值与前个蛋白质重叠。这些标记大多数来自小胶质细胞。为了进一步验证这些发现，作者分析了这些标记物在急性损伤的AD小鼠模型小胶质细胞的转录物和蛋白质水平上是否增加。发现对应于M4模块中蛋白质的前30个差异最大的小胶质细胞转录物严重偏向于抗炎表型(图5d)。此外，发现许多疾病相关的M4小胶质细胞蛋白标记物在经历活性淀粉样斑块吞噬作用的小胶质细胞中增加。总之，作者发现M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块富含阿尔茨海默病遗传风险因子，M4小胶质细胞类型标记似乎偏向于保护性抗炎，而不是有害的促炎小胶质细胞表型。
图5M4模块富集AD遗传风险因子和抗炎性疾病相关的小胶质细胞标记物
M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢蛋白在脑脊液中增加
为了探索来自M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块的蛋白质是否也能够作为AD流体生物标记物，作者分析了来自两个独立队列的脑脊液:Cohort1由名控制组和AD患者组成，Cohort2由96名控制组、AsymAD组和AD组组成。两个队列中的个体都是通过生物标志物分类框架进行分类的(图6a)。两个队列的脑脊液均采用TMT-质谱方法进行分析，没有预先分离，也没有去除高丰度蛋白。
在Cohort1中，发现22种蛋白质定位于大脑中的M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块。它们要么是在AD中增加，要么是没有发生变化，其中10个蛋白统计学意义。在群组1中观察到的最显著增加的M4模块蛋白显示在图6b中，并且包括M4中枢蛋白CD44、过氧化还原蛋白-1(PRDX1)和二甲基精氨酸二甲胺水解酶-2(DDAH2)，以及参与糖酵解的代谢蛋白、乳酸脱氢酶B链(LDHB)和丙酮酸激酶(PKM)。为了验证这些发现，并评估观察到的M4蛋白脑脊液水平的变化是否发生在认知障碍发生之前，作者分析了Cohort2中的个体，其中约三分之一是AsymAD。AsymAD被定义为与AD诊断一致但无认知障碍的β淀粉样蛋白、总tau和磷酸tau的脑脊液水平。在Cohort2中，27种蛋白质存在于M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块。在这27个中，有17个与在发现Cohort1中测得的M4蛋白重叠，并且在ADCSF中显示出相同的变化方向。此外，许多患者还出现了明显或趋势性的认知障碍，包括CD44、LDHB和PKM，并且与认知功能相关(图6c)。总之，多M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白成员可以在人脑脊液中通过质谱进行测量，而无需分离或预先去除高丰度的蛋白。在AsymAD和AD中，这些蛋白质中的许多升高，包括M4中枢蛋白CD44、PRDX1和DDAH2。
图6M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块蛋白水平在阿尔茨海默病和阿尔茨海默病脑脊液中升高
DISCUSSION
在这项研究中，作者通过基于质谱的蛋白质组学分析了多个大脑，以对大脑从正常到无症状和有症状的AD状态过程中发生的蛋白质组学变化达成共识。与疾病最密切相关的蛋白质共表达家族反映了突触、线粒体、RNA结合/剪接和星形胶质细胞/小胶质细胞代谢的生物学功能，与其他生物学过程和功能相比，星形胶质细胞/小胶质细胞代谢与AD最显著相关。随着年龄的增长，M4星形胶质细胞/小胶质细胞代谢模块的表达水平增加，但在阿尔茨海默病中更高，反映了“正常”衰老和阿尔茨海默病之间的共同生物学。M4模块富含阿尔茨海默病遗传风险因子，表明该蛋白共表达模块在疾病发病机制中的潜在致病作用，并在模型系统中起到保护性抗炎作用，表明聚集在该模块中的遗传风险因子多态性可能诱导功能丧失表型。M4星形胶质细胞/微胶质细胞模块蛋白在阿尔茨海默病和阿尔茨海默病脑脊液中增加，表明M4模块中的蛋白可作为阿尔茨海默病进展分期和疾病新治疗方法开发的有用生物标志物。
原文引用｜doi:10./j.ccell..02.
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